Dissertação/Tese do PPGQ
DANIEL AUGUSTO GUEDES REIS MICHEL
Discente de mestradoData: 26/02/2024 Hora: 09:00 Local: Local da defesa
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DANIEL A G R M
Defesa
ResumoPalavras-chave:
Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são amplamente estudados como novas substâncias alternativas ou complementares aos antibióticos convencionais usados no tratamento de doenças infecciosas, principalmente aquelas emergentes de bactérias resistentes. Em geral, estes peptídeos atuam na membrana bacteriana e sua composição e conformações que adquirem ao interagirem com bicamada fosfolipídicas, desempenham um papel crucial em suas atividades biológicas. A configuração dos resíduos de aminoácidos presentes na estrutura primária também exerce um papel importante na atividade antimicrobiana dessas moléculas. Embora a grande maioria dos PAMs naturais são constituídos de aminoácidos em configuração L, a ocorrência de aminoácidos D tem sido relatada para algumas moléculas. Neste trabalho, é avaliada a existência de sinergia em relação ao efeito antibacteriano entre os epímeros D e L das fenilseptinas e das piscidinas 2. Os epímeros das fenilseptinas (D- e L-Phes) são peptideos antimicrobianos naturais, originalmente isolados da pele do anuro Hypsiboas punctatus, compostos por 18 resíduos de aminoácidos (FFFDTLKNLAGKVIGALT-NH2). A epimerização ocorre no segundo resíduo de fenialanina (F) na porção N-terminal, sendo o epímero D mais ativo contra bactérias gram- positivas e gram-negativas em relação ao empímero L. A piscidina 2 (ecPis2s) é um peptídeo antimicrobiano isolado dos órgãos do peixe Epinephelus coioides, e contêm 20 resíduos de aminoácidos (FFFHIIKGLFHAGRMIHGLV-NH2). Coincidentemente, sua estrutura primária também apresenta três resíduos de fenilalanina na região N-terminal como observado nas fenilseptinas. Baseando-se em resultados já conhecidos para os epímeros das fenilsepitinas, neste trabalho foi proposta a síntese do epímero D de ecPis2s, mudando-se a configuração do resíduo de F. O comportamento sinérgico das formulações contendo os epímeros de fenilseptinas e piscidinas 2 foi avaliado em ensaios antibacterianos, ensaio de sinergismo por “tabuleiro de damas” (do inglês checkboard), estudos de toxicidade in vivo, e citotoxicidade in vitro. Além disso, foram realizados estudos de interação com vesículas fosfolipídicas de POPC:POPG (3:1, mol/mol) pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e de atividade lítica com vesículas fosfolipídicas de POPG:CL (2:1, mol/mol) contendo calceína encapsulada. Os dados do ensaio de sinergismo demonstram que as fenilseptinas apresentam um comportamento sinérgico com um ICIF de 0,125, sendo as formulações D-/L-Phes (1:32, mol/mol) e D-/L-Phes (4:1, mol/mol) as mais promissoras dentre as testadas (2 e 4 μg/mL respectivamente). Os dados de atividade lítica mostraram que as formulações D-/L-Phes (1:32, mol/mol) e D-/L-Phes (4:1, mol/mol) também resultaram em maiores percentuais de calceína liberada (95% e 96% respectivamente) do que os epímeros individuais. O ensaio de sinergismo para as piscidinas 2 revelaram um efeito aditivo da sua combinação com um ICIF de 1. A formulação de D-/L-ecPis2s (2:1, mol/mol) apresentou um comportamento similar a das fenilseptinas, com uma maior atividade contra cepas de Salmonella typhymurium (MIC de 50 μM). Os estudos de interação com vesícula mostraram um Kapp de 19,8.103 M-1 , e os estudos de atividade lítica descreveram, em ambos os casos. parâmetros superiores aqueles encontrados para os epímeros isolados. Tanto as formulações quanto os epímeros individuais das fenilseptinas e piscidinas 2 apresentaram uma baixa viabilidade celular. Contudo os ensaios in vivo, descrevem uma toxicidade baixa para os tenébrios com taxa de 100% de sobrevivência para L-ecPis2s e D-/L-ecPis2s (1:1, mol/mol) e de 80% para a formulação de D- /L-Phes (4:1, mol/mol). Esses resultados demonstram que para ambos pares de epímeros dos peptídeos estudados uma combinação de epímeros contribui para uma maior atividade antibacteriana e interação com membranas, além de uma redução nas suas toxicidades em comparação aos peptídeos isolados.
Piscidinas 2;Fenilseptinas; Peptídeo Antimicrobiano; Meio Biomimético; Estudo de Sinergia; Peptídeos Epímeros
AbstractKeywords:
Antimicrobial peptides (AMPs) are extensively studied as new a alternative or a complementary substances to conventional antibiotics used in the treatment of infectious diseases, especially those caused by resistant bacteria. In general, these peptides act on bacterial membrane, and their structures and conformations acquired when interacting with the phospholipid bilayers are essential to their biological activity. In addition, the stereochemistry of the amino acids, which make up their primary structure plays an important role for the function and antimicrobial activity of these molecules. Although the majority of natural AMPs are composed by L-amino acids, the occurrence of D amino acids has been reported for some molecules. In this work, the synergy related to the antibacterial properties was evaluated between the D and L epimers of both phenylseptins and piscidins 2. The phenylseptin epimers (D- and L-Phes) are natural antimicrobial peptides originally isolated from the skin of the anuran Hypsiboas punctatus, and are both composed of 18 amino acid residues (FFFDTLKNLAGKVIGALT-NH2). The epimerization occurs at the second phenyalanine residue (F), at the N-terminal portion, with the D epimer being more active against gram- positive and gram-negative bacteria in relation to the L epimer. On the other hand, Piscidin 2 (ecPis2s) is an antimicrobial peptide isolated from Epinephelus coioides fish, and contains 20 amino acid residues (FFFHIIKGLFHAGRMIHGLV-NH2). Similarly, its primary sequence also presents three phenylalanine residues at the N-terminal region, as observed in the phenylseptins structures. Based on results previously described for the phenylsepitine epimers, the synthesis of the D epimer of ecPis2s was proposed, inverting the configuration of the F residue. The synergistic behavior of the formulations containg phenylseptin and piscidin 2 epimers was evaluated in antibacterial “checkboard” synergism in vivo toxicity and in vitro cytotoxicity assays. Furthermore, interaction studies were carried out with POPC:POPG (3:1, mol/mol) vesicles using the isothermal titration calorimetry (ITC) technique as well as measurements of lytic activity with POPG:CL (2:1, mol/mol) vesicles containing encapsulated calcein. The synergism test demonstrate that phenylseptins exhibit synergistic behavior with an ICIF of 0.125, with the D-/L-Phes (1:32, mol/mol) and D-/L-Phes (4:1, mol/mol) formulations being the most promising ones among the tested samples (2 and 4 μg/mL respectively). The lytic activity data showed that the D-/L-Phes (1:32, mol/mol) and D-/L-Phes (4:1, mol/mol) formulations also lead to higher percentages of calcein released (95% and 96% respectively) in comparision to individual epimers. The synergism test for the piscidins 2 revealed an additive effect of their combination with an ICIF of 1. The D-/L-ecPis2s formulation (2:1, mol/mol) showed similar behavior to the phenylseptins with a greater activity against strains of Salmonella typhymurium (MIC of 50 μM). The membrane interaction studies showed a Kapp of 19.8 x103 M-1 , whereas the lytic activity studies described, in both cases, higher entropic and enthapic contributions than those found for the isolated epimers. The formulations and the individual epimers of phenylseptins and piscidins 2 showed low cell viability. However, in vivo tests describe a low toxicity of tenebrio with a 100% survival rate for L-ecPis2s and D-/L-ecPis2s (1:1, mol/mol) and 80% for the D-/L-Phes formulation (4:1, mol/mol). These results demonstrate that a combination of epimers contributes to greater antibacterial activity and interaction with membranes, in addition to a reduction in toxicity for both pairs of epimers studied.
Piscidins 2; Phenylseptins;Antimicrobial Peptide; Biomimetic Medium; Synergy Study; Peptide Epimers; Antibacterial Activity.
Banca de defesa
PresidenteNacionalidade: Brasileira Ver currículo Lattes Ver ORCID Ver página pessoal
RODRIGO MOREIRA VERLY
Participante internoNacionalidade: Brasileira Ver currículo Lattes Ver página pessoal
ROQUELINE RODRIGUES SILVA
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VICTOR HUGO DE OLIVEIRA MUNHOZ
Participante externoNacionalidade: Brasileira Ver currículo Lattes Ver página pessoal
JARBAS MAGALHÃES RESENDE